基层适宜的宫颈及阴道分泌物检验技术

宫颈分泌物检验的主要目的是检查有无淋球菌及沙眼衣原体感染;阴道分泌物检验的主要目的是检查有无念珠菌、阴道毛滴虫感染及有无细菌性阴道病。上述疾病是一组影响生殖道健康的常见病、多发病,可通过性生活进行传播,属于性传播疾病的范畴。因考虑到患者的顾虑,在妇产科及计划生育系统,它们多被称为生殖道感染性疾病。对于控制女性生殖道感染,国家有指令性的普查防治项目,如原计划生育系统推广的国家免费孕前优生健康检查项目、各级妇幼保健系统执行的孕期及围产期保健项目、及“两癌筛查”项目等。目前,承担这些项目的实际主力军是县、镇、乡的卫生或计划生育服务机构。

基层医疗单位的检验力量相对薄弱,有些传统的生殖道感染性疾病的检验方法,技术要求较高或需要相应的实验室条件作支撑,不能完全适应基层单位的工作情况,难以被基层单位正确掌握和应用,最终影响了这些项目的实施效果。本文就上述疾病的传统检验方法及其应用过程中存在的一些问题做一回顾,并将近年来出现的、适合基层单位使用的检验新方法进行介绍,同时指出了一些不规范、不科学、应该避免使用的检验方法,期望能推进上述检验项目的标准化,提高基层单位检测结果的准确性,增进生殖道感染防治项目的实施效果。

1.标本取材及运送
1.1取材部位的选择
取材部位是否准确是提高检验质量的关键因素,应当从病原体真正的感染及繁殖部位采集标本。

 在基层单位,常见的错误是将阴道分泌物与宫颈分泌物概念不分,影响了标本采集部位的正确选择。在基层单位的常见工作流程是,临床医生在体检病人时,由医生取材,所取的标本交给患者送化验室。由于临床医生与检验科人员之间缺乏沟通、临床医生对于检验的相关知识了解不够,很容易误取阴道分泌物为标本去进行淋球菌、沙眼衣原体检查,其后果将使检验结果不准确,会漏检淋球菌、沙眼衣原体感染者。

正确的取材方法应该是——取宫颈分泌物进行淋球菌、沙眼衣原体检查;取阴道分泌物进行白带常规检测。
淋球菌、沙眼衣原体均主要侵犯泌尿生殖道的柱状上皮细胞。因此,检测淋球菌或沙眼衣原体时,应从柱状上皮部位取材。女性宫颈口内为柱状上皮;宫颈口以外,包括阴道壁均为鳞状上皮,并不是淋球菌、沙眼衣原体的繁殖部位。所以,应当取宫颈分泌物来检测淋球菌、沙眼衣原体。取材方法是先用一拭子揩去宫颈口外堆积的分泌物,弃去,再用另一拭子插入宫颈口内1.0-1.5cm处,捻转数次取出。

阴道分泌物中虽含有来自宫颈溢出的分泌物中的淋球菌或衣原体,但菌浓度大幅下降且多无活性。如果误用阴道分泌物进行淋球菌或沙眼衣原体检查,虽然有时也能出现阳性结果,但其阳性率要比正确部位所标本的阳性率小的多。有人曾经比较数十例女性患者不同部位取材,分离培养淋球菌的阳性率,若以宫颈管内取材为100%,尿道口取材的阳性率为35.2%,而阴道口取材仅29%[1]。所以,误取阴道分泌物作为标本是导致淋球菌培养法失败的第一个重要原因。

阴道毛滴虫、白色念珠菌和阴道加特纳菌则主要引起阴道的疾病,检测这三种病原体应当采集阴道分泌物进行检查,又名“白带检查”。取材方法为阴道窥器扩张阴道后,用拭子沾取阴道后穹窿部位或阴道壁的分泌物。阴道分泌物检查的主要目的是诊断女性有无念珠菌性阴道炎、滴虫性阴道炎及细菌性阴道病。

1.2 标本的运送
不同的检验方法对标本运送的要求不同。凡是进行微生物培养的检验方法,均要求待检微生物在接种前应保持活性,故原则上标本取材后需立即接种到培养基上。但是,在实际工作中往往难以做到床边立即接种。

淋球菌在体外的存活力差,很容易死亡。需要做淋球菌培养的标本,如果不能立即接种,取材后最好能在30分钟内接种到培养基上。标本未能及时接种到培养基上,是导致淋球菌培养方法失败的第二个常见原因。

非培养类的检验方法对标本保存及运送的要求条件相对宽松一些。涂片法要求标本有一定的湿度和新鲜度以保证微生物形态的完整性,抗原检测及DNA检测的标本可在常温或冷藏等适宜条件下保存较长时间,一般可以远距离运送。

2 淋球菌的检验方法
目前,基层卫生或计划生育服务机构采用的淋球菌检测方法比较杂乱,检测水平参差不齐。如涂片法、“发泡试验”、氧化酶快速试条、抗原检测法、培养法等。有些方法不适合基层使用,有些方法缺乏科学性。

2.1. 涂片法虽具有简便、价廉的优点,但不能用于女性淋病的筛查。
涂片法检测男性淋球菌性尿道炎患者的敏感性和特异性可达95%以上,具有初步的诊断价值。但对女性患者,此法的敏感性最高仅30~50%左右,而且需要检验人员有相当丰富的经验。因为女性宫颈、阴道中,杂菌较多,有些杂菌形态与淋球菌相似,涂片镜检难以区分杂菌与淋球菌。因此,世界卫生组织(WHO)不推荐将涂片法用于女性淋病患者的诊断[2]。
有的基层妇幼保健院或计划生育指导站,错误地将涂片法作为女性淋病筛查的唯一方法。其结果将使淋球菌检测项目不能正确筛查出女性淋病携带者,造成该项检测形同虚设,失去设立该项目的实际意义和作用。

2.2. 培养法是诊断淋病的传统 “金标准”方法,可确诊女性淋病患者。但该方法的实用性比较差,难以被基层单位正确掌握。

淋球菌培养法成功的条件是从标本取材、运送到培养结束,均要求始终保持淋球菌的活性。首先,标本要求取自宫颈管,以保证所取的标本中淋球菌具有活性;其次,标本取材后要在短时间内接种到培养基上;最后,淋球菌培养的条件要符合要求。培养过程要求有合适的温度、湿度、CO2环境及质量合格的淋球菌选择性培养基。
取材部位不准确、标本接种不及时、培养条件不佳,是导致淋球菌培养法失败的三个主要原因。
因此,无法满足上述条件的基层单位不建议用培养法来筛查淋病。

2.3. 免疫层析法检测淋球菌抗原的方法,适宜在基层单位中推广应用。
针对基层单位取材部位往往不太准确,标本及时接种多因现实条件限制而有困难的现状,应该在基层单位推广非培养类的淋球菌检验技术。

淋球菌检测方法中的非培养技术,有不依赖标本中淋球菌活性的特点,主要包括核酸类检测方法及抗原类检测方法两大类。

核酸检测类技术(如PCR)需PCR仪,试剂成本昂贵,对检验人员的技术水平及实验室条件均要求较高,不是基层单位的适宜技术。 抗原检测类技术中,目前已商品化的产品有免疫层析法和免疫荧光法两类产品。免疫荧光法因为必须配备荧光显微镜,且操作过程繁琐,报告结果需1小时左右而不适宜在基层单位推广应用。
免疫层析法检测淋球菌抗原的方法,无需任何辅助仪器或设备,操作过程简单快捷,试剂成本适中,是目前条件下,适宜在基层单位中推广应用的淋球菌检测技术。

2.4. 不规范的淋球菌检验方法
目前,有些基层单位使用一些不规范的淋球菌检验方法,如过氧化氢酶试验(俗称“发泡试验”)、氧化酶试条等,这些方法的科学性不够,实际使用的效果也不好,不建议使用。

氧化酶试验及过氧化氢酶试验均是在淋球菌培养之后,对可疑菌落进行的生化鉴定试验。其原理分别是淋球菌产生的氧化酶可作用于氧化酶的反应底物使其变色;及淋球菌产生的过氧化氢酶水解过氧化氢(H2O2)产生氧和水,可在淋球菌菌落上形成细小的气泡。

但是,这些生化反应方法仅适用于在淋球菌培养之后,对可疑菌落进行生化鉴定时使用,并不能直接用于病人标本的检测。因为取自病人的标本中,除淋球菌外,其它的一些杂菌也可以分泌氧化酶或过氧化氢酶。因此,直接用氧化酶底物制成的试剂条与病人标本进行反应;或直接向患者尿液中滴加数滴过氧化氢溶液,摇晃后观察有无泡沫产生来判断是否为淋病,既容易造成假阳性,也可因标本中淋球菌死亡而漏检。

此外,女性淋病主要感染部位是宫颈管柱状上皮,仅少数病例同时合并有尿路感染。用女性尿液做为检测淋球菌的标本本身就是错误的,正确的应该是取宫颈分泌物作为标本。

3.沙眼衣原体检验方法
3.1沙眼衣原体常用的检验方法
沙眼衣原体的实验室检查方法主要分三大类:①细胞培养法:检测过程类似于病毒的分离培养;②分子生物学方法:如PCR测DNA;③ 抗原检测方法:如免疫层析法测抗原。
细胞培养法的实验室技术要求较高,实验成本也较高,且操作繁琐,时间较长,需很好的实验室条件及实验技术,用于临床诊断的比较少,大部分用于科学研究。

分子生物学检测方法主要为荧光定量PCR检测DNA。该类方法的敏感性和特异性均较高,但需昂贵的仪器,严格的实验室条件,要求在经卫生部临床检验中心认可的“临床基因扩增检验实验室”中开展,从而限制了该方法的广泛应用。所以,该类技术也不是基层适宜的检验技术。

沙眼衣原体抗原检测,是国内目前诊断沙眼衣原体感染的主要方法,其中,以免疫层析法最为常见,酶免法及免疫荧光较为少用。 根据已商品化的各种免疫层析法沙眼衣原体抗原检测试剂性能的有关文献报告,该类方法的特异性均比较高,但敏感性往往有不同程度的缺失是其主要缺陷。因此,敏感性成为评价免疫层析法沙眼衣原体试剂盒优劣的核心指标[3]。

3.2 如何选择一个质量更好的沙眼衣原体抗原检测试剂
由于国内市场上商品化的沙眼衣原体抗原检测试剂的品牌较多,用户需在该类试剂中挑选质量更好一些的产品进行使用。

在此,介绍一个简便易行的,可结合自己的日常工作来达到选择最佳产品的方法:
以常用的几种衣原体试剂盒为例,取任意一家的衣原体试剂盒检测结果为强阳性的剩余标本液,原液为第一管;从第一管中取原液200μl,加生理盐水200μl混匀为第二管;从第二管中取混匀液200μl,加生理盐水200μl混匀为第三管;从第三管中取混匀液200μl,加生理盐水200μl混匀为第四管;依此类推,可以得到更高稀释比例的待测样品……
 
分别从第一、二、三、四……等管中各取100μl作为模拟标本,按各厂家试剂盒的标本处理方法,分别用各试剂盒的标本处理液进行处理并用各试剂盒进行检测,比较各个试剂盒能检测出的最高稀释度。能检测出更高稀释度模拟标本的试剂盒性能更优越。
上述方法比较的是各个试剂盒的分析灵敏度。分析灵敏度与临床敏感性呈正相关,可以在很大程度上代表该试剂盒的临床敏感性。

3.3 不规范的衣原体检验方法
目前,在工作中常见的、不规范的衣原体检测方法,主要有两种,一是取血清或血浆为标本,检测沙眼衣原体抗体的方法;二是取宫颈分泌物,检测宫颈上皮细胞中糖原含量的方法。

由于沙眼衣原体主要侵犯男性前尿道或女性宫颈部位,属于局部感染,病原体刺激人体免疫系统产生抗体的能力有限。尽管血清中会出现抗体,但抗体与病情之间的关联性差。此外,抗体持续时间长,抗体试验阳性不能区分既往感染与新近感染。所以,检测血清中衣原体抗体的方法在诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染时通常无意义。
此外,市场上有检测宫颈或阴道脱落上皮细胞中糖原含量,来判断有无衣原体感染的试剂盒供应。该类试剂的检测原理不严谨,缺乏理论依据,属于不规范的检测技术。

4. 淋球菌及沙眼衣原体联合检测的问题
淋球菌与沙眼衣原体感染部位相同,均为宫颈管内柱状上皮。所以,从理论上而言,可以用同一根宫颈分泌物取材拭子为标本,满足淋球菌及沙眼衣原体两个检测项目的需要。

淋球菌与沙眼衣原体常合并感染。在淋菌性尿道炎患者中,约15%~35%合并有衣原体感染[4]。淋病与沙眼衣原体感染的治疗方案不同,为了及时、准确地诊断宫颈炎的病因并分别给予准确的治疗,在实际工作中,有必要同时进行淋球菌及沙眼衣原体两项检测。
国内已有商品化的淋球菌、沙眼衣原体抗原二联检测试剂盒供应。据介绍,仅需一支宫颈拭子标本,在15分钟之内,可同时得到淋球菌、沙眼衣原体两项检测结果。该方法从科学性和实用性两方面,均是比较适宜在基层推广应用的技术。

5. 鼓励基层单位采用先进的阴道分泌物检验技术,推进白带常规检验项目的标准化。
5.1 传统的白带常规显微镜检查方法的优缺点
传统的白带常规检验方法为涂片镜检法,具有成本低廉,报告结果快速的优点。
但是,传统镜检法属于形态学检查,需要比较有经验的检验人员,借助显微镜仔细查找有无念珠菌、阴道毛滴虫、线索细胞等。检验人员的经验及责任心对检验结果的影响比较大,而基层单位往往缺乏有经验的检验人员。所以,传统镜检法因人为误差较大而难以标准化。
除人为误差影响因素之外,镜检法本身的敏感性也有限。凡是能造成菌体破裂等影响菌体形态完整性的因素、如就诊前用药,均可对镜检法的准确性造成较大影响。剔除人为因素的影响,全世界范围内所公认的,镜检法对外阴阴道念珠菌病的敏感性约为60%左右。
另外,传统镜检法一般要求标本取材后立即检测,不宜保存及远距离运送,否则会影响镜检结果的准确性。比如,滴虫离体后不能存活太长时间,滴虫死亡后缺乏特征性的运动形态,将难以观察。基层单位有时承担着下乡任务,无法随时携带显微镜,难以进行现场检测。
目前,缺乏与临床标本状态相似的标准质控品,以致在实际工作中,很难对涂片法进行质量控制和管理。

5.2 采用白带常规检验新技术,可以促进该项检验的标准化以及开展质量管理
近年来,出现一些新的阴道分泌物检验方法,如免疫层析法检测念珠菌、阴道毛滴虫抗原,pH测试卡诊断细菌性阴道病的方法。据相关文献报道,新方法的敏感性、特异性均比较令人满意。新技术的操作方法简单快捷、结果客观易读,可以大幅度减少人为主观误差,促进白带常规检验项目的标准化。同时,新方法具有,标本可在常温下放置一周而不影响检测结果的准确性,患者就诊前用药等影响因素对结果的干扰少等优点。这些优点非常有利于主管部门开展室间质评、室内质控等质量管理工作。

6. 在基层单位中推广使用快速、准确的生殖道感染检验方法的重要性
6.1 世界卫生组织SDI计划介绍
世界卫生组织曾经在2001年制定了性传播疾病诊断试剂发展纲要(Sexually transmitted diseases Diagnostic Initiative,SDI)。其核心思想是,在全球范围内,鼓励科研机构及相关企业研发快速简便的性病诊断试剂,并在发展中国家大力推广应用[5]。
SDI计划对所需诊断试剂提出了7条标准,将每条标准的首字母合并缩写后,简称为ASSURED标准。这七条标准分别是,物美价廉(Affordable)、敏感性好(Sensitive)、特异性高(Specific)、操作简便(User-friendly)、快速客观(Rapid and robust)、无需仪器(Equipment-free)、容易运输(Deliverable to end-users)。
上述快速的、可进行床边即时诊断的试剂被统称为POCT(Point-Of-Care-Test)类诊断试剂,是近年来迅速发展的一类检验方法。世界卫生组织认为,也许POCT类诊断方法的准确性比分子生物学方法或传统微生物培养方法略差 ,但因为可以立即得到化验结果,无需患者等待化验结果而复诊,克服了发展中国家的患者复诊率不高的影响,POCT类诊断方法对治疗患者所起到的最终效果反而比准确度更高的试剂要大。
比如,假设POCT试剂的准确度为85%,患者因可以立即得到化验结果而被治疗,其最终的效果是,有85%的患者得到正确的治疗。

假设,另有一其它方法的准确度为100%,但需等待2天才能取得化验结果,患者需要2天后复诊才能得到治疗。患者的复诊率受到经济条件、交通便捷性等多种因素的影响。在发展中国家的初级卫生保健机构,患者的复诊率一般不会超过60%。这样,即使该检验方法准确性为100%,但因不够快速而需要患者复诊,如复诊率在60%的情况下,使用该方法的最终效果是,仅有60%的病人得到了准确的治疗。  所以,世界卫生组织认为,在发展中国家的性传播疾病防治中,应该优先推广POCT类快速检验方法,其综合的防治效果将优于其它类型的检验方法。

6.2 在中国的生殖道感染防治项目中推广POCT类检验技术的必要性
国家卫生和计划生育委员会以及相关基金会等非政府组织,推广实施了一些生殖道感染普查防治项目。承担并具体实施上述项目的单位往往是县、镇、乡等基层卫生或计划生育服务机构。中国是世界上最大的发展中国家,各地区的经济发展水平差距较大,基层单位检验科的硬件设施、检验人员的相关知识及技术能力参差不齐。

在以往进行的大规模群体性筛查中,暴露出一些问题。以女性淋病的筛查为例,很多基层单位选择涂片法、或“发泡实验”、或氧化酶试条来进行筛查,致使淋病筛查的结果不理想。2013年,某省在实施国家免费孕前优生健康检查项目中,总计筛查了几十万育龄妇女,其结果是无一例淋病患者被发现。据中国疾病预防控制中心、全国性病麻风病控制中心的报告,2013年全国的淋病发病率平均为7.61/10万。

在设计生殖道感染防治项目具体的技术服务方案时,应充分考虑到承担项目实施任务的基层单位的工作条件及工作能力,使该方案不但具有科学性、还应具有可行性,以便能够达到所期望的实施效果。世界卫生组织SDI计划,倡导在发展中国家使用快速简便、又比较准确的检验方法的思想,对中国的生殖道感染防治工程有借鉴和指导意义。世界卫生组织提出的7条标准,是对所需快速诊断方法的理想要求。

随着科学技术的不断进步,新的性病诊断方法不断涌现。近年来,有一系列的快速简便、又比较准确可靠的性病诊断试剂在国内上市供应。比如,乳胶免疫层析法淋病奈瑟球菌抗原检测、沙眼衣原体抗原检测、淋球菌/沙眼衣原体抗原二联检测;白色念珠菌抗原检测、阴道毛滴虫抗原检测、白色念珠菌/阴道毛滴虫抗原二联检测、及细菌性阴道病检测试剂卡等快速诊断试剂,均属于POCT快速诊断方法的范畴,涵盖了目前最常见的阴道炎及宫颈炎的快速检测。

在对宫颈及阴道分泌物的大规模群体性筛查中,采用POCT快速诊断方法,具有如下优点:(1)降低了对标本采集、运输及保存环节的要求,适合基层单位的实际工作情况;(2)降低了对实验条件及对实验人员的技术要求,可广泛应用于各级水平的单位;(3)统一了检验方法、操作过程、结果判读,推进了检验的标准化程度,便于主管部门对检验质量进行统一的管理和控制。

综上所述,在大规模、群体性生殖道感染防治项目中,应该采用统一的,标准化的检验方法;使用快速简便、准确可靠的诊断试剂是项目实施成功的前提条件。

参考文献
1. 叶顺章.性传播疾病的实验室诊断[M].第2版.北京:科学出版社,2009:34.
2. Van Dyck E, Meheus ZA,Piot P. Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases [M]. Geneva: World Health Organization, 1999: 1-21
3. Yin Y P,R. W Peeling,X S Chen,et al. Clinic-based evaluation of Clearview Chlamydia MF for detection of Chlamydia trachomatis in vaginal and cervical specimens from women at high risk in China[J]. Sex Transm Infect,2006,82(Suppl. 5):33–37.
4.叶顺章,邵长庚.性病诊疗与预防[M].第2版.北京:人民卫生出版社,2011:200.
5. Peeling R. W,K K Holmes,D Mabey,et al. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward[J]. Sex Transm Infect,2006,82(Suppl. 5):1–6.


发布时间: 2020-11-30

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